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###########################################################################################################
# to use : /home/bogdan/R/R-4.0.0.install/bin/R
# we have replaced : samples.combined.list.combined to samples.combined
# the script : 16june2020 ;
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
set.seed(423)
library(Cairo)
options(bitmapType='cairo')
library(conos)
library(liger)
library(harmony)
library(dplyr)
library(edgeR)
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(SeuratWrappers)
library(cowplot)
library(Matrix)
library(gridExtra)
library(ggplot2)
library(future)
library(future.apply)
plan("multiprocess", workers = 4)
options(future.globals.maxSize = 64000 * 1024^2)
###########################################################################################################
###########################################################################################################
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###########################################################################################################
# The following tutorial is designed to give you an overview of the kinds of comparative analyses on complex cell types that are possible using the Seurat integration procedure.
#, we address three main goals:
# Identify cell types that are present in both datasets
# Obtain cell type markers that are conserved in both control and stimulated cells
# Compare the datasets to find cell-type specific responses to stimulation
###########################################################################################################
########################################################################################################### Setup the Seurat objects
# InstallData("ifnb")
# data("ifnb")
# NAME="zamples.control.ifnb"
# str(ifnb)
# Formal class 'Seurat' [package "Seurat"] with 12 slots
# ..@ assays :List of 1
# .. ..$ RNA:Formal class 'Assay' [package "Seurat"] with 8 slots
# .. .. .. ..@ counts :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int [1:9787436] 20 27 37 64 65 83 87 131 139 175 ...
# .. .. .. .. .. ..@ p : int [1:14000] 0 877 1590 2440 3549 4183 4740 5720 6301 7181 ...
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 14053 13999
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:14053] "AL627309.1" "RP11-206L10.2" "LINC00115" "NOC2L" ...
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13999] "AAACATACATTTCC.1" "AAACATACCAGAAA.1" "AAACATACCTCGCT.1" "AAACATACCTGGTA.1" ...
# .. .. .. .. .. ..@ x : num [1:9787436] 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 ...
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ data :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int [1:9787436] 20 27 37 64 65 83 87 131 139 175 ...
# .. .. .. .. .. ..@ p : int [1:14000] 0 877 1590 2440 3549 4183 4740 5720 6301 7181 ...
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 14053 13999
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:14053] "AL627309.1" "RP11-206L10.2" "LINC00115" "NOC2L" ...
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:13999] "AAACATACATTTCC.1" "AAACATACCAGAAA.1" "AAACATACCTCGCT.1" "AAACATACCTGGTA.1" ...
# .. .. .. .. .. ..@ x : num [1:9787436] 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 ...
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ scale.data : num[0 , 0 ]
# .. .. .. ..@ key : chr "rna_"
# .. .. .. ..@ var.features : logi(0)
# .. .. .. ..@ meta.features:'data.frame': 14053 obs. of 0 variables
# .. .. .. ..@ misc : symbol NULL
# .. .. .. ..@ NA : NULL
# ..@ meta.data :'data.frame': 13999 obs. of 5 variables:
# .. ..$ orig.ident : chr [1:13999] "IMMUNE_CTRL" "IMMUNE_CTRL" "IMMUNE_CTRL" "IMMUNE_CTRL" ...
# .. ..$ nCount_RNA : num [1:13999] 3017 2481 3420 3156 1868 ...
# .. ..$ nFeature_RNA : int [1:13999] 877 713 850 1109 634 557 980 581 880 669 ...
# .. ..$ stim : chr [1:13999] "CTRL" "CTRL" "CTRL" "CTRL" ...
# .. ..$ seurat_annotations: Factor w/ 13 levels "CD14 Mono","CD4 Naive T",..: 1 1 1 12 3 1 7 2 6 1 ...
# ..@ active.assay: chr "RNA"
# ..@ active.ident: Factor w/ 2 levels "IMMUNE_CTRL",..: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
# .. ..- attr(*, "names")= chr [1:13999] "AAACATACATTTCC.1" "AAACATACCAGAAA.1" "AAACATACCTCGCT.1" "AAACATACCTGGTA.1" ...
# ..@ graphs : list()
# ..@ neighbors : list()
# ..@ reductions : list()
# ..@ project.name: chr "ifnb"
# ..@ misc : list()
# ..@ version :Classes 'package_version', 'numeric_version' hidden list of 1
# .. ..$ : int [1:3] 3 0 0
# ..@ commands : list()
# ..@ tools : list()
# write.table(as.data.frame(ifnb@meta.data),
# file=paste(NAME, "meta.data.START.txt", sep="."),
# quote=FALSE, sep="\t",
# row.names = TRUE, col.names = TRUE)
# colnames(as.data.frame(ifnb[["RNA"]]@counts))
# rownames(as.data.frame(ifnb[["RNA"]]@counts))
# write.table(colnames(as.data.frame(ifnb[["RNA"]]@counts)),
# file=paste(NAME, "meta.data.START.COLNAMES.txt", sep="."),
# quote=FALSE, sep="\t",
# row.names = TRUE, col.names = TRUE)
# write.table(rownames(as.data.frame(ifnb[["RNA"]]@counts)),
# file=paste(NAME, "meta.data.START.ROWNAMES.txt", sep="."),
# quote=FALSE, sep="\t",
# row.names = TRUE, col.names = TRUE)
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
# ifnb.list <- SplitObject(ifnb, split.by = "stim")
# $CTRL
# An object of class Seurat
# 14053 features across 6548 samples within 1 assay
# Active assay: RNA (14053 features)
# $STIM
# An object of class Seurat
# 14053 features across 7451 samples within 1 assay
# Active assay: RNA (14053 features)
################################################## the matrices look the same :
# ifnb.list$CTRL[["RNA"]]@counts
# ifnb.list$CTRL[["RNA"]]@data
################################################## the matrices look the same :
# ifnb.list$STIM[["RNA"]]@counts
# ifnb.list$STIM[["RNA"]]@data
########################################################################################################### SPLIT
########################################################################################################### OBJECT
# info regarding SPLIT OBJECT :
# assign the test object a three level attribute : an example from the MANUAL
########################################################################################################### an
########################################################################################################### example
# groups <- sample(c("group1", "group2", "group3"), size = 80, replace = TRUE)
# names(groups) <- colnames(samples_small)
# head(samples_small@meta.data)
# orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA RNA_snn_res.0.8
# ATGCCAGAACGACT SeuratProject 70 47 0
# CATGGCCTGTGCAT SeuratProject 85 52 0
# GAACCTGATGAACC SeuratProject 87 50 1
# TGACTGGATTCTCA SeuratProject 127 56 0
# AGTCAGACTGCACA SeuratProject 173 53 0
# TCTGATACACGTGT SeuratProject 70 48 0
# letter.idents groups RNA_snn_res.1
# ATGCCAGAACGACT A g2 0
# CATGGCCTGTGCAT A g1 0
# GAACCTGATGAACC B g2 0
# TGACTGGATTCTCA A g2 0
# AGTCAGACTGCACA A g2 0
# TCTGATACACGTGT A g1 0
# samples_small <- AddMetaData(object = samples_small, metadata = groups, col.name = "group")
# head(samples_small@meta.data)
# orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA RNA_snn_res.0.8
# ATGCCAGAACGACT SeuratProject 70 47 0
# CATGGCCTGTGCAT SeuratProject 85 52 0
# GAACCTGATGAACC SeuratProject 87 50 1
# TGACTGGATTCTCA SeuratProject 127 56 0
# AGTCAGACTGCACA SeuratProject 173 53 0
# TCTGATACACGTGT SeuratProject 70 48 0
# letter.idents groups RNA_snn_res.1 group
# ATGCCAGAACGACT A g2 0 group2
# CATGGCCTGTGCAT A g1 0 group2
# GAACCTGATGAACC B g2 0 group3
# Splits object based on a single attribute into a list of subsetted
# objects, one for each level of the attribute. For example, useful
# for taking an object that contains cells from many patients, and
# subdividing it into patient-specific objects.
# SplitObject(object, split.by = "ident")
# obj.list <- SplitObject(samples_small, split.by = "group")
# Splits object based on a single attribute into a list of subsetted
# objects, one for each level of the attribute. For example, useful
# for taking an object that contains cells from many patients, and
# subdividing it into patient-specific objects.
# SplitObject(object, split.by = "ident")
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
# from a tutorial on ZINB-WAVE :
################################################## the matrices look the same :
# ifnb.list$CTRL[["RNA"]]@counts
# ifnb.list$CTRL[["RNA"]]@data
################################################## the matrices look the same :
# ifnb.list$STIM[["RNA"]]@counts
# ifnb.list$STIM[["RNA"]]@data
###########################################################################################################
########################################################################################################### OUTPUT the folder CTRL
# library("Matrix")
# data_mtx_CTRL <- GetAssayData(ifnb.list$CTRL[["RNA"]], slot="counts")
# write.table(rownames(data_mtx_CTRL), file="features.data_mtx_CTRL.tsv", sep="\t", col.names=FALSE, row.names=FALSE, quote=FALSE)
# write.table(colnames(data_mtx_CTRL), file="barcodes.data_mtx_CTRL.tsv", sep="\t", col.names=FALSE, row.names=FALSE, quote=FALSE)
# Matrix::writeMM(data_mtx_CTRL, file="data_mtx_CTRL.mtx")
########################################################################################################### OUTPUT the folder STIM
###########################################################################################################
# library("Matrix")
# data_mtx_STIM <- GetAssayData(ifnb.list$STIM[["RNA"]], slot="counts")
# write.table(rownames(data_mtx_STIM), file="features.data_mtx_STIM.tsv", sep="\t", col.names=FALSE, row.names=FALSE, quote=FALSE)
# write.table(colnames(data_mtx_STIM), file="barcodes.data_mtx_STIM.tsv", sep="\t", col.names=FALSE, row.names=FALSE, quote=FALSE)
# Matrix::writeMM(data_mtx_STIM, file="data_mtx_STIM.mtx")
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
############################################################################################### to VERIFY the PIPELINE after we read again :
###############################################################################################
# DIR_CTRL="/media/bogdan/e7a05079-e4ce-4cfa-b0cd-bf2d7a54b46d/PIPELINE_SEURAT3/data_CTRL_again4/"
# DIR_STIM="/media/bogdan/e7a05079-e4ce-4cfa-b0cd-bf2d7a54b46d/PIPELINE_SEURAT3/data_STIM_again4/"
###############################################################################################
###############################################################################################
# ctrl.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL)
# stim.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM)
# colnames(ctrl.data) <- paste(CTRL, colnames(ctrl.data), sep="-")
# colnames(stim.data) <- paste(STIM, colnames(stim.data), sep="-")
# read10X(mtx="matrix.mtx", genes="features.tsv", barcodes="barcodes.tsv")
# Error in read10X(mtx = "matrix.mtx", genes = "features.tsv", barcodes = "barcodes.tsv")
# it does not work ...
# read10X(mtx="data_mtx_CTRL.mtx", genes="features.data_mtx_CTRL.tsv", barcodes="barcodes.data_mtx_CTRL.tsv")
# str(data_mtx_CTRL)
#Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# ..@ i : int [1:4626015] 20 27 37 64 65 83 87 131 139 175 ...
# ..@ p : int [1:6549] 0 877 1590 2440 3549 4183 4740 5720 6301 7181 ...
# ..@ Dim : int [1:2] 14053 6548
# ..@ Dimnames:List of 2
# .. ..$ : chr [1:14053] "AL627309.1" "RP11-206L10.2" "LINC00115" "NOC2L" ...
# .. ..$ : chr [1:6548] "AAACATACATTTCC.1" "AAACATACCAGAAA.1" "AAACATACCTCGCT.1" "AAACATACCTGGTA.1" ...
# ..@ x : num [1:4626015] 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 ...
# ..@ factors : list()
# str(data_mtx_STIM)
# Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# ..@ i : int [1:5161421] 7 10 20 25 27 79 87 113 176 194 ...
# ..@ p : int [1:7452] 0 588 1380 1964 2696 3242 4558 5140 5702 6210 ...
# ..@ Dim : int [1:2] 14053 7451
# ..@ Dimnames:List of 2
# .. ..$ : chr [1:14053] "AL627309.1" "RP11-206L10.2" "LINC00115" "NOC2L" ...
# .. ..$ : chr [1:7451] "AAACATACCAAGCT.1" "AAACATACCCCTAC.1" "AAACATACCCGTAA.1" "AAACATACCCTCGT.1" ...
# ..@ x : num [1:5161421] 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
# ..@ factors : list()
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### NAMES
CTRL1="WT.1M"
STIM1="DIS.1M"
CTRL2="WT.2M"
STIM2="DIS.2M"
CTRL3="WT.3M"
STIM3="DIS.3M"
CTRL4="WT.4M"
STIM4="DIS.4M"
CTRL5="WT.5M"
STIM5="DIS.5M"
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
DDIR_CTRL1 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_1M_WT/"
DIR_STIM1 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_1M_DIS/"
DIR_CTRL2 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_2M_WT"
DIR_STIM2 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_2M_DIS"
DIR_CTRL3 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_3M_WT"
DIR_STIM3 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_3M_DIS"
DIR_CTRL4 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_4M_WT"
DIR_STIM4 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_4M_DIS"
DIR_CTRL5 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_5M_WT"
DIR_STIM5 = "/labs/scRNAseq/cell_aggregate_samples_5M_DIS"
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
NAME <- paste("integrated", sep=".")
LIST.KNOWN.MARKERS = read.delim("a.LIST.MARKERS.RETINA.mouse.txt", header=T, sep="\t", stringsAsFactors=F) ### to read the LIST at the start..
### in the folders above :
###############################################################################################
############################################################################################### THRESHOLDS
# RESOLUTION = 0.6
RESOLUTION = 0.4
THRESHOLD_min_counts <- 600
THRESHOLD_max_counts <- 20000
THRESHOLD_min_genes <- 600
THRESHOLD_max_genes <- 2500
THRESHOLD_mito <- 20
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
###############################################################################################
# ctrl.data <- read.table("control_expression_matrix.txt.gz", sep = "\t")
# stim.data <- read.table("stimulated_expression_matrix.txt.gz", sep = "\t")
###############################################################################################
###############################################################################################
ctrl1.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL1)
stim1.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM1)
colnames(ctrl1.data) <- paste(CTRL1, colnames(ctrl1.data), sep="-")
colnames(stim1.data) <- paste(STIM1, colnames(stim1.data), sep="-")
###############################################################################################
###############################################################################################
ctrl2.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL2)
stim2.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM2)
colnames(ctrl2.data) <- paste(CTRL2, colnames(ctrl2.data), sep="-")
colnames(stim2.data) <- paste(STIM2, colnames(stim2.data), sep="-")
###############################################################################################
###############################################################################################
ctrl3.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL3)
stim3.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM3)
colnames(ctrl3.data) <- paste(CTRL3, colnames(ctrl3.data), sep="-")
colnames(stim3.data) <- paste(STIM3, colnames(stim3.data), sep="-")
###############################################################################################
###############################################################################################
ctrl4.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL4)
stim4.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM4)
colnames(ctrl4.data) <- paste(CTRL4, colnames(ctrl4.data), sep="-")
colnames(stim4.data) <- paste(STIM4, colnames(stim4.data), sep="-")
###############################################################################################
###############################################################################################
ctrl5.data <- Read10X(data.dir = DIR_CTRL5)
stim5.data <- Read10X(data.dir = DIR_STIM5)
colnames(ctrl5.data) <- paste(CTRL5, colnames(ctrl5.data), sep="-")
colnames(stim5.data) <- paste(STIM5, colnames(stim5.data), sep="-")
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#######################################################################################################################
#### making the objects for all the samples
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### making SEURAT OBJECTS : 1
#######################################################################################################################
ctrl1 <- CreateSeuratObject(ctrl1.data, project = CTRL1)
head(colnames(ctrl1[["RNA"]]@counts))
head(ctrl1@meta.data)
# GetAssayData(ctrl1)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(ctrl1[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(ctrl1[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL1, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(ctrl1[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL1, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##################################################################################################################
##################################################################################################################
stim1 <- CreateSeuratObject(stim1.data, project = STIM1)
head(colnames(stim1[["RNA"]]@counts))
head(stim1@meta.data)
# GetAssayData(stim1)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(stim1[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(stim1[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM1, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(stim1[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM1, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### making SEURAT OBJECTS : 2
#######################################################################################################################
ctrl2 <- CreateSeuratObject(ctrl2.data, project = CTRL2)
head(colnames(ctrl2[["RNA"]]@counts))
head(ctrl2@meta.data)
# GetAssayData(ctrl2)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(ctrl2[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(ctrl2[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL2, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(ctrl2[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL2, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##################################################################################################################
##################################################################################################################
stim2 <- CreateSeuratObject(stim2.data, project = STIM2)
head(colnames(stim2[["RNA"]]@counts))
head(stim2@meta.data)
# GetAssayData(stim2)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(stim2[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(stim2[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM2, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(stim2[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM2, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### making SEURAT OBJECTS : 3
#######################################################################################################################
ctrl3 <- CreateSeuratObject(ctrl3.data, project = CTRL3)
head(colnames(ctrl3[["RNA"]]@counts))
head(ctrl3@meta.data)
# GetAssayData(ctrl3)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(ctrl3[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(ctrl3[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL3, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(ctrl3[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL3, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##################################################################################################################
##################################################################################################################
stim3 <- CreateSeuratObject(stim3.data, project = STIM3)
head(colnames(stim3[["RNA"]]@counts))
head(stim3@meta.data)
# GetAssayData(stim3)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(stim3[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(stim3[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM3, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(stim3[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM3, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### making SEURAT OBJECTS : 4
#######################################################################################################################
ctrl4 <- CreateSeuratObject(ctrl4.data, project = CTRL4)
head(colnames(ctrl4[["RNA"]]@counts))
head(ctrl4@meta.data)
# GetAssayData(ctrl4)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(ctrl4[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(ctrl4[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL4, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(ctrl4[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL4, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##################################################################################################################
##################################################################################################################
stim4 <- CreateSeuratObject(stim4.data, project = STIM4)
head(colnames(stim4[["RNA"]]@counts))
head(stim4@meta.data)
# GetAssayData(stim4)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(stim4[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(stim4[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM4, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(stim4[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM4, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
#######################################################################################################################
####################################################################################################################### making SEURAT OBJECTS : 5
#######################################################################################################################
ctrl5 <- CreateSeuratObject(ctrl5.data, project = CTRL5)
head(colnames(ctrl5[["RNA"]]@counts))
head(ctrl5@meta.data)
# GetAssayData(ctrl5)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(ctrl5[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(ctrl5[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL5, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(ctrl5[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", CTRL5, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##################################################################################################################
##################################################################################################################
stim5 <- CreateSeuratObject(stim5.data, project = STIM5)
head(colnames(stim5[["RNA"]]@counts))
head(stim5@meta.data)
# GetAssayData(stim5)[1:10, 1:10]
# as.data.frame(stim5[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),])
write.table(as.data.frame(stim5[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM5, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(stim5[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", STIM5, "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
####################################################################################################################################################################################################################################
####################################################################################################################################################################################################################################
################################################################################################################## it adds ID to specific CELLS !
##################################################################################################################
# samples.combined <- merge(x=ctrl, y = stim, add.cell.ids = c(CTRL, STIM), project = "TUTORIAL")
####################################################################################################################################################################################################################################
####################################################################################################################################################################################################################################
##################################################################################################################
##################################################################################################################
samples.combined1 <- merge(x=ctrl1, y = stim1)
samples.combined1
head(colnames(samples.combined1))
tail(colnames(samples.combined1))
head(samples.combined1@meta.data)
tail(samples.combined1@meta.data)
table(samples.combined1$orig.ident)
head(colnames(samples.combined1[["RNA"]]@counts))
tail(colnames(samples.combined1[["RNA"]]@counts))
head(colnames(samples.combined1[["RNA"]]@data))
tail(colnames(samples.combined1[["RNA"]]@data))
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
################################################################################################################## we can use all the samples or,
################################################################################################################## if we want to reduce the number of samples, we do get the following
samples.combined2 <- merge(x=samples.combined1, y = c(ctrl2, stim2, ctrl3, stim3, ctrl4, stim4, ctrl5, stim5))
# samples.combined2 <- merge(x=samples.combined1, y = c(ctrl3, stim3, ctrl5, stim5))
# samples.combined2 <- merge(x=samples.combined1, y = c(ctrl5, stim5))
samples.combined2
# samples.combined2
# An object of class Seurat
# 25399 features across 119074 samples within 1 assay
# Active assay: RNA (25399 features, 0 variable features)
head(colnames(samples.combined2))
tail(colnames(samples.combined2))
head(samples.combined2@meta.data)
tail(samples.combined2@meta.data)
table(samples.combined2$orig.ident)
head(colnames(samples.combined2[["RNA"]]@counts))
tail(colnames(samples.combined2[["RNA"]]@counts))
head(colnames(samples.combined2[["RNA"]]@data))
tail(colnames(samples.combined2[["RNA"]]@data))
# STZ.1M STZ.2M STZ.3M STZ.4M STZ.5M WT.1M WT.2M WT.3M WT.4M WT.5M
# 9500 13749 15088 14882 13797 9206 8946 13996 10701 9209
# to print RBPMS for verifications :
write.table(as.data.frame(samples.combined2[["RNA"]]@counts[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.COUNTS", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", "COMBINED", "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
write.table(as.data.frame(samples.combined2[["RNA"]]@data[c("Rbpms"),]),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "Rbpms", "in.assay.RNA.sample", "COMBINED", "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
dim(samples.combined2[["RNA"]]@counts)
dim(samples.combined2[["RNA"]]@data)
# dim(samples.combined2[["RNA"]]@data)
# [1] 25399 119074
# dim(samples.combined2[["RNA"]]@counts)
# [1] 25399 119074
dim(samples.combined2@meta.data)
# 119074 3
write.table(as.data.frame(samples.combined2@meta.data),
file=paste(NAME, "figure2.DATA", "the.META.DATA", "in.assay.RNA.sample", "COMBINED", "txt", sep="."),
sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
# write.table(as.data.frame(samples.combined2[["RNA"]]@counts),
# file=paste(NAME, "figure2.DATA", "the.COUNTS.DATA", "in.assay.RNA.sample", "COMBINED", "txt", sep="."),
# sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
# write.table(as.data.frame(samples.combined2[["RNA"]]@data),
# file=paste(NAME, "figure2.DATA", "the.DATA.DATA", "in.assay.RNA.sample", "COMBINED", "txt", sep="."),
# sep="\t", quote=FALSE, col.names = TRUE, row.names = TRUE)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
### to save memory
rm(ctrl1)
rm(stim1)
rm(ctrl2)
rm(stim2)
rm(ctrl3)
rm(stim3)
rm(ctrl4)
rm(stim4)
rm(ctrl5)
rm(stim5)
### to continue the analysis using the variable : samples.combined
samples.combined = samples.combined2
rm(samples.combined2)
rm(samples.combined1)
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
##############################################################################################################################################################################################################################################
########################################################################################################### compute the QC on the MITO GENES
# rownames(samples.combined[["RNA"]]@data)
# samples.combined[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(samples.combined, pattern = "^MT-") #### 've change to MT
samples.combined[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(samples.combined, pattern = "^mt-|^MT-|^Mt") #### 've change to MT
# from the other script :
# mito.genes <- grep(pattern = "^mt-|^MT-|^Mt", x = rownames(x=pbmc[["RNA"]]@data), value = TRUE)
# mito.genes
head(samples.combined@meta.data)
tail(samples.combined@meta.data)
VlnPlot(samples.combined, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
ggsave(paste(NAME, "figure1.samples.combined", "VIOLIN.PLOT.genes.counts.mito.plots", "png", sep="."), width=38, height=18, units = "cm")
# group.by: Group (color) cells in different ways (for example, orig.ident) ###### by DEFAULT
# split.by: A variable to split the violin plots by, see ‘FetchData’ for more details
# rownames(samples.combined[["RNA"]]@counts)
# rownames(samples.combined[["RNA"]]@data)
###########################################################################################################
########################################################################################################### DISPLAY
plot1 <- FeatureScatter(samples.combined, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(samples.combined, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
ggsave(paste(NAME, "figure1.samples.combined", "FEATURE.SCATTER.genes.counts.mito.plots", "png", sep="."), width=38, height=18, units = "cm")
###########################################################################################################
###########################################################################################################
########################################################################################################### shall we FILTER the INTEGRATED DATA at this STEP :
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
# THRESHOLD_genes <- 500
# THRESHOLD_mito <- 20
# samples.combined <- subset(samples.combined, percent.mt <= THRESHOLD_mito) #### FILTERING based on MITO GENES
# samples.combined
# THRESHOLD_min_genes <- 500
# THRESHOLD_max_genes <- 20000
# samples.combined <- subset(samples.combined, nCount_RNA > THRESHOLD_min_counts & nCount_RNA < THRESHOLD_max_counts)
# samples.combined <- subset(samples.combined, nFeature_RNA > THRESHOLD_min_genes & nFeature_RNA < THRESHOLD_max_genes)
samples.combined <- subset(samples.combined, nFeature_RNA > THRESHOLD_min_genes & percent.mt < THRESHOLD_mito)
samples.combined
# THRESHOLD_min_counts <- 500
# THRESHOLD_max_counts <- 20000
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
########################################################################################################### to verify if the pipeline gives the same results
###########################################################################################################
########################################################################################################### using the same parameters as at the begining
# ifnb = samples.combined
# dim(ifnb)
# [1] 25399 10354
samples.combined.list <- SplitObject(samples.combined, split.by = "orig.ident")
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
samples.combined.list <- lapply(X = samples.combined.list, FUN = function(x) {
x <- NormalizeData(x)
x <- FindVariableFeatures(x, selection.method = "vst")
})
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
# Next, select features for downstream integration, and run PCA on each object in the list, which is required for running the reciprocal PCA workflow.
samples.combined.features <- SelectIntegrationFeatures(object.list = samples.combined.list)
samples.combined.list <- lapply(X = samples.combined.list, FUN = function(x) {
x <- ScaleData(x, features = samples.combined.features, verbose = TRUE)
x <- RunPCA(x, features = samples.combined.features, verbose = TRUE)
})
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
########################################################################################################### Perform integration
###########################################################################################################
###########################################################################################################
###########################################################################################################
# We then identify anchors using the FindIntegrationAnchors function, which takes a list of Seurat objects as input,
# and use these anchors to integrate the two datasets together with IntegrateData.
# samples.combined.list.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = samples.combined.list, dims = 1:20, reduction = "rpca") ##### !!!!!!
# samples.combined.list.combined <- IntegrateData(anchorset = samples.combined.list.anchors, dims = 1:20)
################################### we do add a REFERENCE DATASET, and we chose it at 1M (WT, STZ)
reference_dataset <- which(names(samples.combined.list) == c("WT.1M", "STZ.1M"))
samples.combined.list.anchors <- FindIntegrationAnchors(object.list = samples.combined.list,
dims = 1:30,
reduction = "rpca",
reference = reference_dataset, ##### !!!!!!
verbose = TRUE)
samples.combined.list.combined <- IntegrateData(anchorset = samples.combined.list.anchors, dims = 1:30)
### hmm, we do get ... warning: Adding a command log without an assay associated with it !!!!!!!!!!!!!!!!
str(samples.combined.list.combined)
# Formal class 'Seurat' [package "Seurat"] with 12 slots
# ..@ assays :List of 2
# .. ..$ RNA :Formal class 'Assay' [package "Seurat"] with 8 slots
# .. .. .. ..@ counts :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int [1:6614279] 195 252 320 321 347 391 428 493 517 615 ...
# .. .. .. .. .. ..@ p : int [1:7292] 0 536 1081 1694 2386 2953 3454 4096 5531 6339 ...
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 25399 7291
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:25399] "AABR07000089.1" "Vom2r6" "Vom2r5" "Raet1e" ...
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:7291] "WT.1M-AAACCTGAGATCCCAT" "WT.1M-AAACCTGAGGGCTCTC" "WT.1M-AAACCTGCAGTCACTA" "WT.1M-AAACCTGCATATACCG" ...
# .. .. .. .. .. ..@ x : num [1:6614279] 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 ...
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ data :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int [1:6614279] 195 252 320 321 347 391 428 493 517 615 ...
# .. .. .. .. .. ..@ p : int [1:7292] 0 536 1081 1694 2386 2953 3454 4096 5531 6339 ...
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 25399 7291
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:25399] "AABR07000089.1" "Vom2r6" "Vom2r5" "Raet1e" ...
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:7291] "WT.1M-AAACCTGAGATCCCAT" "WT.1M-AAACCTGAGGGCTCTC" "WT.1M-AAACCTGCAGTCACTA" "WT.1M-AAACCTGCATATACCG" ...
# .. .. .. .. .. ..@ x : num [1:6614279] 2.62 2.62 2.62 2.62 2.62 ...
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ scale.data : num[0 , 0 ]
# .. .. .. ..@ key : chr "rna_"
# .. .. .. ..@ assay.orig : NULL
# .. .. .. ..@ var.features : logi(0)
# .. .. .. ..@ meta.features:'data.frame': 25399 obs. of 0 variables
# .. .. .. ..@ misc : NULL
# .. ..$ integrated:Formal class 'Assay' [package "Seurat"] with 8 slots
# .. .. .. ..@ counts :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int(0)
# .. .. .. .. .. ..@ p : int 0
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 0 0
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : NULL
# .. .. .. .. .. .. ..$ : NULL
# .. .. .. .. .. ..@ x : num(0)
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ data :Formal class 'dgCMatrix' [package "Matrix"] with 6 slots
# .. .. .. .. .. ..@ i : int [1:3034473] 1 6 219 308 318 366 372 547 577 612 ...
# .. .. .. .. .. ..@ p : int [1:7292] 0 35 71 115 158 196 228 264 535 588 ...
# .. .. .. .. .. ..@ Dim : int [1:2] 2000 7291
# .. .. .. .. .. ..@ Dimnames:List of 2
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:2000] "Arr3" "Cst3" "Pde6h" "Apoe" ...
# .. .. .. .. .. .. ..$ : chr [1:7291] "WT.1M-AAACCTGAGATCCCAT" "WT.1M-AAACCTGAGGGCTCTC" "WT.1M-AAACCTGCAGTCACTA" "WT.1M-AAACCTGCATATACCG" ...
# .. .. .. .. .. ..@ x : num [1:3034473] 3.95 3.28 2.62 2.62 3.67 ...
# .. .. .. .. .. ..@ factors : list()
# .. .. .. ..@ scale.data : logi [1, 1] NA
# .. .. .. ..@ key : chr "integrated_"
# .. .. .. ..@ assay.orig : NULL
# .. .. .. ..@ var.features : chr [1:2000] "Arr3" "Cst3" "Pde6h" "Apoe" ...
# .. .. .. ..@ meta.features:'data.frame': 2000 obs. of 0 variables
# .. .. .. ..@ misc : NULL
# ..@ meta.data :'data.frame': 7291 obs. of 4 variables:
# .. ..$ orig.ident : chr [1:7291] "WT.1M" "WT.1M" "WT.1M" "WT.1M" ...
# .. ..$ nCount_RNA : num [1:7291] 786 806 882 1016 833 ...
# .. ..$ nFeature_RNA: int [1:7291] 536 545 613 692 567 501 642 1435 808 2127 ...
# .. ..$ percent.mt : num [1:7291] 8.14 5.71 6.01 5.91 5.52 ...
# ..@ active.assay: chr "integrated"
# ..@ active.ident: Factor w/ 2 levels "STZ.1M","WT.1M": 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ...
# .. ..- attr(*, "names")= chr [1:7291] "WT.1M-AAACCTGAGATCCCAT" "WT.1M-AAACCTGAGGGCTCTC" "WT.1M-AAACCTGCAGTCACTA" "WT.1M-AAACCTGCATATACCG" ...
# ..@ graphs : list()
# ..@ neighbors : list()
# ..@ reductions : list()
# ..@ project.name: chr "SeuratProject"
# ..@ misc : list()
# ..@ version :Classes 'package_version', 'numeric_version' hidden list of 1
# .. ..$ : int [1:3] 3 1 3
# ..@ commands :List of 2
# .. ..$ FindIntegrationAnchors :Formal class 'SeuratCommand' [package "Seurat"] with 5 slots
# .. .. .. ..@ name : chr "FindIntegrationAnchors"
# .. .. .. ..@ time.stamp : POSIXct[1:1], format: "2020-02-12 15:03:29"
# .. .. .. ..@ assay.used : Named chr [1:2] "RNA" "RNA"
# .. .. .. .. ..- attr(*, "names")= chr [1:2] "WT.1M" "STZ.1M"
# .. .. .. ..@ call.string: chr [1:2] "FindIntegrationAnchors(object.list = samples.combined.list, dims = 1:20, " " reduction = \"rpca\")"
# .. .. .. ..@ params :List of 14
# .. .. .. .. ..$ assay : Named chr [1:2] "RNA" "RNA"
# .. .. .. .. .. ..- attr(*, "names")= chr [1:2] "WT.1M" "STZ.1M"
# .. .. .. .. ..$ anchor.features : chr [1:2000] "Arr3" "Cst3" "Pde6h" "Apoe" ...
# .. .. .. .. ..$ scale : logi TRUE
# .. .. .. .. ..$ normalization.method: chr "LogNormalize"
# .. .. .. .. ..$ reduction : chr "pca"
# .. .. .. .. ..$ l2.norm : logi TRUE
# .. .. .. .. ..$ dims : int [1:20] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ...
# .. .. .. .. ..$ k.anchor : num 5
# .. .. .. .. ..$ k.filter : logi NA
# .. .. .. .. ..$ k.score : num 30
# .. .. .. .. ..$ max.features : num 200
# .. .. .. .. ..$ nn.method : chr "rann"
# .. .. .. .. ..$ eps : num 0
# .. .. .. .. ..$ verbose : logi TRUE
# .. ..$ PairwiseIntegrateReference:Formal class 'SeuratCommand' [package "Seurat"] with 5 slots
# .. .. .. ..@ name : chr "PairwiseIntegrateReference"
# .. .. .. ..@ time.stamp : POSIXct[1:1], format: "2020-02-12 15:03:35"
# .. .. .. ..@ assay.used : NULL
# .. .. .. ..@ call.string: chr [1:6] "PairwiseIntegrateReference(anchorset = anchorset, new.assay.name = new.assay.name, " " normalization.method = normalization.method, features = features, " " features.to.integrate = features.to.integrate, dims = dims, " " k.weight = k.weight, weight.reduction = weight.reduction, " ...
# .. .. .. ..@ params :List of 12
# .. .. .. .. ..$ new.assay.name : chr "integrated"
# .. .. .. .. ..$ normalization.method : chr "LogNormalize"
# .. .. .. .. ..$ features : chr [1:2000] "Arr3" "Cst3" "Pde6h" "Apoe" ...
# .. .. .. .. ..$ features.to.integrate: chr [1:2000] "Arr3" "Cst3" "Pde6h" "Apoe" ...
# .. .. .. .. ..$ dims : int [1:20] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ...
# .. .. .. .. ..$ k.weight : num 100
# .. .. .. .. ..$ sd.weight : num 1
# .. .. .. .. ..$ sample.tree : int [1, 1:2] -1 -2
# .. .. .. .. ..$ preserve.order : logi FALSE
# .. .. .. .. ..$ do.cpp : logi TRUE
# .. .. .. .. ..$ eps : num 0
# .. .. .. .. ..$ verbose : logi TRUE
# ..@ tools :List of 1
# .. ..$ Integration:Formal class 'IntegrationData' [package "Seurat"] with 7 slots
# .. .. .. ..@ neighbors : NULL
# .. .. .. ..@ weights : NULL
# .. .. .. ..@ integration.matrix: NULL
# .. .. .. ..@ anchors :'data.frame': 2586 obs. of 5 variables:
# .. .. .. .. ..$ cell1 : num [1:2586] 2808 3982 445 1041 1059 ...
# .. .. .. .. ..$ cell2 : num [1:2586] 12 26 31 31 31 31 31 36 36 36 ...
# .. .. .. .. ..$ score : num [1:2586] 0.1515 0.0606 0.8788 0.9697 1 ...