cryo-EM，特别是SPA，发展越来越成熟，从数据收集到处理，流程已经非常完善。3D refine仍然是最耗时的步骤：低SNR，ill-posed问题。
结构异质性（structural heterogeneity）问题，是结构生物学的一个重要问题，主要是生物大分子（例如蛋白质、核酸）并非处于一种构象，见Figure 1。
- 构象异质性（conformational heterogeneity）
- 组分异质性（compositional heterogeneity）
当前成熟的算法主要处理不含异质性，或者含有少量异质性的数据。主要方法是类似K-means的3D分类算法，能够处理的异质性为若干离散类的异质性。
- 关于异质性的探索通常需要依赖一定的正则，否则问题更加ill-posed。再加上低信噪比，有过多的参数容易过拟合。
- 现有3D分类方法（RELION、CryoSPARC、THUNDER）使用了一个spectral noise model来防止过拟合。
- 3D分类将颗粒拆分为离散的类别，但是SNR和颗粒数量呈线性关系，这使得颗粒数不足的数据很难使用3D分类获得好结果。
- 3D分类需要人工监督、手动调整参数，反复重跑试错。
本文综述其他结构异质性建模方法，这些方法会给每个颗粒赋予一个结构异质性参数，该参数决定了该颗粒对应的构象。如前所述，这会导致参数过多容易过拟合。因此对于结构异质性的建模需要一定的正则。作者认为这些方法，特别是深度学习，很难估计误差和过拟合程度。
模型：
- 算法(\mathcal{F})，将每个颗粒映射到结构异质性参数；
- 算法(\mathcal{G})，将每个构象异质性参数映射到构象；
- 某种形式的正则。
Eg. 线性模型，例如3D分类，3DVA： [\min\left|\frac{1}{\sigma^2}\left[y-\mathcal{C}\mathcal{P}\left(\sum_{i=1}^K z_iV_i\right)\right]\right|^2]
Eg. 非线性模型，例如VAE： [z=\mathcal{F}(y)] [\min\left|\frac{1}{\sigma^2}\left[y-\mathcal{C}\mathcal{P}\mathcal{G}(z)\right]\right|^2]
Overfitting的来源：
- Memorization？
- 极低的SNR。
- 实域 v.s. Fourier域
- Fourier域：传统方法，更方便计算一些算子：投影（取截面）、CTF等。
- 实域：更方便建模一些正则，例如：mask、局部形变、光滑性等。Figure 2。
Table 1.